Preview

Российские нанотехнологии

Расширенный поиск

Определение структуры децеллюляризированных дермальных матриксов

https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-7-8-51-56

Полный текст:

Аннотация

Одним из важнейших аспектов регенеративной медицины является подбор матрикса — биологического каркаса тканеинженерной конструкции. Для наилучшей воспроизводимости структуры и свойств поврежденной ткани, а также поддержания клеточной адгезии и пролиферации оптимальным является использование матриксов, полученных при децеллюляризации нативных органов с последующей рецеллюляризацией различными клеточными линиями. Методами растровой электронной микроскопии в режиме естественной среды и сканирующей импульсной ультразвуковой микроскопии определена микроструктура нативных и децеллюляризированных матриксов дермальных тканей.

ВВЕДЕНИЕ

Повреждения кожных покровов — одна из наи­более часто встречающихся патологий в совре­менном мире [1, 2]. Такие виды повреждений, как ожоги, скальпированные раны, механические травмы кожи, требуют безотлагательного лечения [3]. В зависимости от обширности дефекта исполь­зуют консервативное или хирургическое лечение [4, 5]. При хирургическом лечении применяют ме­тодику аутотрансплантации кожи с неповрежден­ного участка тела на место дефекта [6, 7]. Однако данная методика не может быть применена в пол­ном объеме при обширных ранениях кожных по­кровов вследствие нехватки трансплантационного материала [8, 9]. Разработка биоинженерных кар­касов кожи с последующим заселением их ауто­логичными клетками позволило бы приблизиться к решению проблемы нехватки трансплантацион­ного материала для закрытия обширных дефектов [10]. Также данный метод позволит избежать до­полнительной травматизации донора-реципиента при заборе кожи для пересадки.

Тканевая инженерия — активно развивающее­ся в настоящее время направление [11—13]. Одним из важных аспектов является подбор биоадекватного каркаса тканеинженерной конструкции — матрикса. Наиболее биохимически совместимыми материалами являются децеллюляризированные ткани, которые состоят из коллагена, а также несут в себе набор матриклеточных белков, влияющих на адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеточных культур [14—16]. Тем не менее при­родные бесклеточные каркасы имеют ряд недо­статков — необходимо тщательно контролировать их биомеханическое поведение в зависимости от степени децеллюляризации [17]. Подходы реге­неративной медицины предполагают использова­ние тканеинженерных конструкций, полученных при децеллюляризации нативных органов с после­дующей рецеллюляризацией различными клеточ­ными линиями [18—21]. Указанный биологический каркас должен соответствовать определенным тре­бованиям: воспроизводить структуру нативной ткани, не обладать иммуногенными свойствами, а также поддерживать клеточную адгезию и проли­ферацию. Немаловажную роль играет максималь­ное сохранение биохимического состава и биоме­ханических свойств полученного внеклеточного матрикса (ВКМ). Определение микроструктуры ВКМ на различных стадиях формирования не­обходимо для выбора оптимальных режимов их подготовки, для их возможной дифференциации. Как правило, для получения микроструктурных данных используют оптическую микроскопию и растровую электронную микроскопию (РЭМ) [22—25]. При использовании РЭМ, как правило, проводят замещение жидкости спиртом с после­дующей сушкой, затем напыление золота [22, 24], платины [21, 23] и заморозку в жидком азоте [25]. Подготовка образцов с помощью этих методик мо­жет сопровождаться появлением артефактов, по­этому необходим контроль с помощью других ме­тодик приготовления образцов или других методов исследования микроструктуры.

В настоящей работе исследования матриксов проводили методами РЭМ в режиме естественной среды. Этот метод позволяет проводить исследова­ния биологических образцов без дополнительной пробоподготовки, в гидратированном состоянии, близком к нативному, за счет контролируемых зна­чений температуры, влажности и давления в камере РЭМ [26]. С помощью РЭМ в режиме окружающей среды успешно изучена смачиваемость губчатых полимерных материалов на основе коллагена [27] и микроструктура различных биомедицинских ма­териалов [28—32]. Растровая электронная микро­скопия в режиме окружающей среды обеспечивает возможность изучения процессов гидратации/де­гидратации образца [33] и динамических измене­ний его структуры. В результате использования по­ниженного ускоряющего напряжения в приборах с новыми электронно-оптическими системами, в том числе высокочувствительных детекторов, стало возможным обойти проблему зарядки не­электропроводящих образцов без напыления ме­таллических или углеродных пленок, необходимых для снятия заряда.

Кроме этого, для сравнения результатов ис­пользована сканирующая акустическая микроско­пия (САМ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Децеллюляризация. При разработке оптималь­ного протокола децеллюляризации дермальных матриксов в качестве лабораторных животных использовали трех свиней породы Ландрас в воз­расте 3-4 мес. массой 15000 ± 200 г. Содержание животных соответствовало правилам, приня­тым Европейской конвенцией по защите позво­ночных животных (Страсбург, 1986), Principles on Good Laboratory Practice (OECD, ENV/ MC/ CUEM (98)17, 1997), ГОСТу 33044-2014 и При­казу 199н “Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики” от 01.04.2016, “Руковод­ству по проведению доклинических исследований лекарственных средств” (Часть первая. М.: Гриф и К, 2013). Премедикацию проводили препаратом Комбистресс, для введения в наркоз и его поддер­жания использовали перфузию Пропофолом в уш­ную вену с начальной скоростью 3 мг/кг. Дерматом и участок кожи, на котором планировали проведе­ние манипуляции, смазывали глицерином. Экс­плантацию кожного лоскута проводили в два этапа. Сначала дерматомом с установленной толщиной среза 3 мм удаляли эпидермальный слой. Второй этап представлял собой непосредственно проце­дуру изъятия дермального лоскута толщиной 7 мм, который в последующем использовали при раз­работке протокола децеллюляризации. Изъятый образец помещали в раствор PBS с 5%-ным ани- биотиком-антимикотиком для предотвращения контаминации дермы. Децеллюляризацию выпол­няли детергент-энзиматическим методом в автор­ской модификации ранее использованных кол­лективом авторов протоколов [34]. Общее время выполнения исследования составило 72 ч. В ка­честве основного рабочего раствора использовали 4%-ный Deoxycholate с добавлением 1 М раствора NaOH. Перед воздействием детергентов дермальный матрикул помещали в лабораторный стакан на орбитальный шейкер; время воздействия соста­вило 4 астрономических часа (семь циклов). Затем на кожный лоскут воздействовали раствором фос­фатного буфера PBS с добавлением бычьей панкре­атической ДНКазы в течение двух циклов по 2 ч. При разработке протокола децеллюляризации дер- мального матрикса пристальное внимание уделяли времени промывания в растворе PBS после воздей­ствия детергентом для удаления остатков клеточ­ных структур и ДНК, что контролировали с помо­щью метода количественного определения ДНК. Образцы нативной ткани и дермального матрик­са исследовали после каждого цикла воздействия детергентом методом рутинной гистологии. По­сле забора образцы фиксировали в 10%-ном ней­тральном забуференном формалине и подвергали гистологической проводке, далее были заключены в парафин. Качество проведенной децеллюляри- зации оценивали при окрашивании гематоксили­ном и эозином и флуорофором (4',6-диамидино- 2-фенилиндола) DAPI. Спектрофотометрическим методом определяли количество остаточной ДНК в нативном и децеллюляризированном дермаль- ном лоскуте по стандартному протоколу.

Растровая электронная микроскопия в режи­ме окружающей среды. Морфологию образцов изучали методом РЭМ в режиме окружающей среды (ESEM — Environmental Scanning Electron Microscopy). Исследование проводили с помощью растрового электронного микроскопа Versa 3D DualBeam (FEI, США), оснащенного столиком с пельтье-охлаждением. Исследование проводили при температуре 4°С с последовательным пониже­нием влажности водяных паров в камере микро­скопа со 100 до 40%. Данные получены при ускоря­ющем напряжении 10 кВ и токе 93 пА с помощью детектора вторичных электронов для получения изображений в газообразной среде GSED (Gaseous Secondary Electron Detector).

Сканирующая акустическая микроскопия. Для ультразвуковых исследований использовали сканирующий импульсный акустический микро­скоп SIAM—2 модель 2009—2011, разработанный в лаборатории акустической микроскопии Инсти­тута биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, с акустической линзой на рабочей частоте 100 МГц и угловой апертурой 11°. Фокусное рас­стояние данной линзы в иммерсии составляет 5.5 мм, диаметр фокального пятна 40 мкм, длина фокальной перетяжки 0.9 мм. В качестве иммерси­онной жидкости для сканирования во всех экспе­риментах использовали дистиллированную воду.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в процессе децеллюляри- зации по разработанному протоколу, согласно полученным при морфологических исследова­ниях данным, не произошло значительного по­вреждения матрикса при отсутствии клеточных структур и полной сохранности архитектоники ткани, что подтверждалось окрашиванием ге­матоксилином и эозином и флуорофором DAPI. При этом весьма критичным является адекват­ное и длительное отмывание матрикса от остат­ков детергентов в фосфатном буфере, что зна­чительно снижает вероятность нежелательных реакций на получаемый биологический мате­риал. При количественном определении уровня ДНК в нативных и децеллюляризированных об­разцах кожи установлено, что около 52% ядерно­го материала было удалено в процессе децеллю- ляризации.

Результаты РЭМ в режиме окружающей среды. Примеры РЭМ-изображений, полученных в ре­жиме окружающей среды, внешней и внутренней частей нативных и децеллюляризированных об­разцов кожи представлены на рис. 1 и 2 соответ­ственно. При изучении нативных образцов наблю­даются волокна и клеточные компоненты (рис. 1а, 1б, 2а, 2б). В децеллюляризированных дермальных образцах определяется сохранная архитектоника, отсутствуют патологические деформации компо­нентов ВКМ на фоне отсутствия клеточных эле­ментов (рис. 1в, 1г, 2в, 2г). Волокна ВКМ струк­турны, сохраняют морфологические признаки, свойственные коллагеновым волокнам четвертого типа, пространственная ориентация волокон со­хранена.

 

Рис. 1. РЭМ-изображения внешней части нативных (а, б) и децеллюляризированных дермальных тканей (в, г), полученные в режиме окружающей среды.

 

 

Рис. 2. РЭМ-изображения внутренней части нативных (а, б) и децеллюляризированных дермальных тканей (в, г), полученные в режиме естественной среды.

 

При этом в децеллюляризированных дермаль- ных образцах на фоне сохранения архитектоники отсутствуют патологические деформации компо­нентов ВКМ и отсутствуют клеточные элементы. Тем не менее можно отметить, что изображения нативного и децеллюляризированного матриксов кожи различаются незначительно. Это на пер­вый взгляд противоречит данным других иссле­дований децеллюляризированных тканей [21, 22, 25], в том числе кожи. По всей видимости, данный факт связан с особенностями классиче­ского метода пробоподготовки для сканирую­щей электронной микроскопии: сушкой в среде сверхкритического диоксида углерода. Методика удаления воды без капиллярных эффектов с при­менением сверхкритического СО2 включает в себя стадии обезвоживания тканей путем замещения воды на спирт и ацетон, которые смешиваются с этим сверхкритическим растворителем. Одна­ко при такой проводке децеллюляризированной ткани также происходит удаление матриклеточных белков и полисахаридов, входящих в состав внеклеточного матрикса: эластина, фибрина, ламинина, гликозаминогликаны. Таким образом, применение метода РЭМ в режиме окружающей среды позволило показать наличие значительно­го объема белков и полисахаридов ВКМ, которые будут оказывать значительное влияние на адге­зию клеток.

Результаты сканирующей акустической ми­кроскопии. Вследствие неявного подтверждения наличия коллагеновых волокон по данным РЭМ для подтверждения их сохранности в децеллюляризированных образцах были проведены из­мерения с применением САМ. Изображения в САМ также были получены от двух видов об­разцов кожи: нативных и децеллюляризированных. Для достижения большей информативно­сти были получены акустические изображения образов двух типов — B/D-сканы и С-сканы, соответствующие поперечным и продольным срезам кожи при изготовлении срезов во вре­мя гистологической обработки (рис. 3) [34, 35]. На акустических изображениях нативных об­разцов (рис. 3а), соответствующих поперечным срезам, отчетливо видны структуры нормаль­ной ткани: эпидермис, базальная мембрана, со­сочки дермы.

 

Рис. 3. Акустические изображения (B/D-сканы) нативной (а) и децеллюляризированной кожи свиньи: 1 — эпидер­мис, 2 — базальная мембрана, 3 — дерма, 4 — дермальные сосочки.

 

Для получения натурального матрикса кожи используется только дермальная часть образцов, так как ВКМ эпидермиса слабо развит и не может использоваться в дальнейшем. Таким образом, перед началом децеллюляризации эпидермис удаляли механическим способом, расщеплением кожного лоскута. На акустических изображени­ях децеллюляризированной кожи (рис. 4б) виден ВКМ дермального слоя. В отличие от дермы на­тивной кожи (рис. 4а) децеллюляризированная дерма обладает меньшей структурированностью эластических и коллагеновых волокон, их на­правленностью, также утрачена волнообразная поверхность дермы, соответствующая дермаль- ным сосочкам, за счет механического и химиче­ского воздействия.

 

Рис. 4. Акустические изображения (С-сканы) нативной (а) и децеллюляризированной (б) кожи свиньи: 1 — воло­сы, 2 — крупные коллагеновые волокна, 3 — хаотично расположенные эластические волокна.

 

Продольные акустические изображения были получены в субэпидермальном слое нативных образцов и в приповерхностном децеллюляризированных (рис. 4а, 4б). Данные, получен­ные при B/D-сканировании, подтверждаются и на С-сканах: у децеллюляризированных образ­цов утрачены крупные коллагеновые волокна, поверхность сглажена, снижен акустический кон­траст за счет уменьшения степени структурирован­ности как всего дермального слоя, так и отдельных волокон.

На обоих изображениях (рис. 3б, 4б) децеллюляризированная ткань представляет собой не во­локнистую или губчатую, а непрерывную струк­туру.

ВЫВОДЫ

Создание тканеинженерных конструкций на основе ацеллюлярных дермальных матрик­сов очень важно для закрытия больших дефектов кожи. Такие конструкции могут использоваться в качестве временных или постоянных раневых покрытий. Новые методы исследования тканеин­женерных конструкций на основе ацеллюлярных дермальных матриксов позволяют получить новые данные о микроструктуре без влияния процеду­ры приготовления образцов и высокого вакуума в электронном микроскопе. В этом случае не про­исходит повреждающего воздействия на внекле­точный матрикс в связи с отсутствием необхо­димости высушивания образцов и проведением исследования по влажной среде, близкой к среде, в которой проводили децеллюляризацию.

Проведенные ранее исследования на многих децеллюляризированных матриксах показали, что компоненты ВКМ способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, дифференцировку, а также ответное ремоделирование тканей реципиента. По-видимому, такой эффект связан с трехмерной ультраструктурой ВКМ, свой­ствами его поверхности, а также с остатками бел­ков и полисахаридов исходного ВКМ в ацеллюлярных тканях. В рамках проведенного исследования показано, что популярные и активно применяе­мые методики пробоподготовки оказывают зна­чительное влияние на структуру матрикса. Таким образом, визуализация и контроль структуры децеллюляризированных матриксов — нерешенная и требующая комплексного подхода задача.

Об авторах

Р. А. Камышинский
Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”; Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН Москва
Россия
Москва


К. Г. Антипова
Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Россия
Москва


Е. В. Куевда
Научно-исследовательский институт медицинской приматологии
Россия
Сочи


Д. М. Кузнецова
Кубанский государственный медицинский университет
Россия
Краснодар


Т. Д. Пацаев
Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Россия
Москва


Е. С. Мороков
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Россия
Москва


Е. А. Храмцова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Россия
Москва


Д. Я. Алейник
Приволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России
Россия
Нижний Новгород


М. Н. Егорихина
Приволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России
Россия
Нижний Новгород


Т. Е. Григорьев
Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Россия
Москва


Е. А. Губарева
Научно-исследовательский институт медицинской приматологии
Россия
Сочи


А. Л. Васильев
Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”; Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН Москва
Россия
Москва


Список литературы

1. Парамонов Б.А., Поремский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги. СПб.: Спецлит, 2000. 288 с.

2. Алексашин М.Ю. // Скорая медицинская помощь. 2006. Т. 7. № 3. С. 221.

3. Азолов В.В., Дмитриев Г.И. Хирургическое лечение последствий ожогов. Н. Новгород: ННИИТО, 1995. 184 с.

4. Крылов К.М. Реабилитация пострадавших с ожогами. Уч. пособие. Вып. VIII. СПб.: ОГК, 2002. 33 с.

5. Barret J.P. // British Medical Journal. 2004. V. 329. P. 274.

6. Дейкало В.П., Толстик А.Н. // Новости хирургии. 2015. № 5. C. 577.

7. Папаскири Д.Г., Ефименко Н.А., Махарашвили А.А. и др. // Трансплантология. 2018. № 3–4. С. 68.

8. Barret J.P. // British Medical Journal. 2004. V. 329. P. 274.

9. Xin Z.J., Qin Z., Wen N.Y. et al. // Burns. 2010. V. 36. № 8. P. 1296.

10. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Рахаев A.M. // Анналы хирургии. 2001. № 1. С. 59.

11. Badylak S.F. // Anat. Rec. B. New Anat. 2005. V. 287. P. 36.

12. Atala A. // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2007. V. 1. P. 83.

13. Atala A., Bauer S.B., Soker S., Yoo J.J., Retik A.B. // Lancet. 2006. V. 367. P. 1241.

14. Kanematsu A., Yamamoto S., Ozekiet M. et al // Biomaterials. 2004. V. 25. № 18. P. 4513.

15. Badylak S.F., Taylor D., Uygun K. // Annu Rev. Biomed. Eng. 2011. V. 13. P. 27.

16. Conconi M.T., De Coppi P., Bellini S. et al. // Biomaterials. 2005. V. 26. № 15. Р. 2567.

17. Gilbert T.W. // J. Cellular Biochemistry. 2012. V. 113. № 7. P. 2217.

18. Gubareva E.A., Sjöqvist S., Gilevich I.V. et al. // Biomaterials. 2016. № 77. P. 320.

19. Baptista P.M., Orlando G., Mirmalek-Sani S.-H. et al. // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2009. P. 6526.

20. Ott H.C., Matthiesen T.S., Goh S.K. et al. // Nature Med. 2008. V. 14. № 2. P. 213.

21. Milan P.B., Pazoukid A., Joghataeia M.T. et al. // Methods (San Diego, Calif.). 2019. DOI: 10.1016/j.ymeth.2019.07.005.

22. Luo J.-C., Chen W., Chen X.-H. et al. // Biomaterials. 2011. V. 32. P. 706.

23. Zhang Q., Johnson J.A., Dunne L.W. et al // Acta Biomaterialia. 2016. V. 35. P. 166.

24. Wu S., Liu Y., Bharadwaj S., Atala A., Zhang Y. // Biomaterials. 2011. V. 32. P. 1317.

25. Mendoza-Novelo B., Avila E.E., Cauich-Rodríguez J.V. et al. // Acta Biomaterialia. 2011. V.7. P.1241.

26. Muscariello L., Rosso F., Marino G. et al. // J. Cell. Physiol. 2005. V. 205. P. 328.

27. Ruozi B., Tosi G., Leo E. et al. // Mater. Sci. Eng. C. 2007. V. 27. P. 802.

28. Stokes D.J., Rea S.M., Porter A.E. et al. // Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 2002. V. 711. P. 113.

29. Chen J., Birch M.A., Bull S.J. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2010. V. 21. P. 277.

30. Maia-Brigagão C., de Souza W. // Micron. 2012. V. 43. P. 494.

31. Bridier A., Meylheuc T., Briandet R. // Micron. 2013. V. 48. P. 65.

32. Gatti A.M., Kirkpatrick J., Gambarelli A. et al. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2008. V. 19. P. 1515.

33. Morris A.H., Chang J., Kyriakides T.R. // Biores. Open Access. 2016. V. 5. № 1. P. 177.

34. Morokov E., Khramtsova E., Kuevda E. et al. // Artif Organs. 2019. V. 43. P. 1104. DOI: 10.1111/aor.13516.

35. Khramtsova Е., Morokov E., Lukanina К. et al. // Polymer Engineering & Science. 2017. V. 57. № 7. P. 697. DOI: 10.1002/pen.24617.


Просмотров: 52


ISSN 1992-7223 (Print)