Preview

Российские нанотехнологии

Расширенный поиск

Применение наночастиц золота для высокочувствительного поляризационного флуоресцентного аптамерного анализа охратоксина А

https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-7-8-91-99

Полный текст:

Аннотация

Предложено применение наночастиц золота (НЧЗ) в качестве носителей для снижения предела обнаружения поляризационного флуоресцентного (ПФ) аптамерного анализа. ПФ-анализ основывается на различиях флуорофора, конъюгированного с аналитом и облучаемого плоскополяризованным светом, по степени деполяризации излучаемого света до и после связывания аналита с рецептором. Применение аптамеров в качестве рецепторов в таком анализе ограничено из-за их небольшой молекулярной массы и соответственно недостаточного влияния на поляризацию. Данное ограничение может быть устранено посредством включения аптамеров в крупные межмолекулярные комплексы. Показаны преимущества НЧЗ как унифицированного, стабильного и легкомодифицируемого носителя для аптамеров. ПФ-аптамерный анализ реализован с применением НЧЗ, имеющих средний диаметр 8.7 нм, и охратоксина А (ОТА) в качестве целевого аналита. Анализ апробирован для тестирования проб белого вина. Достигнутый предел обнаружения ОТА — 2.3 мкг/кг, что в 25 раз ниже, чем при использовании нативного аптамера. Продолжительность анализа — 15 мин. Предлагаемый подход может применяться для аптамерного анализа различных низкомолекулярных соединений.

ВВЕДЕНИЕ

Одно из лидирующих мест среди используе­мых в биологии и медицине наноматериалов за­нимают наночастицы золота (НЧЗ) [1, 2]. Разра­ботано большое количество способов получения НЧЗ различного диаметра и формы, что расши­ряет их потенциал как носителей для биологиче­ски активных молекул [3, 4]. Наночастицы золота широко применяются для биосенсорики [5—7], в том числе с использованием нуклеиновых кис­лот (НК) в качестве рецепторов. Первые аналити­ческие разработки с использованием комплексов НЧЗ—НК были основаны на их агрегации за счет гибридизации одноцепочечных ДНК, сопрово­ждающейся изменениями оптических свойств [8, 9]. Наряду с гибридизационными тестами ком­плексы НЧЗ—НК востребованы при работе с апта- мерами — одноцепочечными олигонуклеотидами, способными селективно связывать молекулярные мишени разной химической природы благодаря своей пространственной структуре [10, 11]. Аф­финности аптамеров и антител сопоставимы [12], при этом аптамеры обладают рядом преимуществ: унифицированное и недорогое получение химиче­ским синтезом, простота модификации, возмож­ность эффективной ренатурации [13]. Конъюгаты НЧЗ—аптамер нашли применение для направлен­ной доставки лекарственных препаратов [14, 15] и в различных аналитических системах — коло­риметрических [16—18], люминесцентных [19—21] и электрохимических [22].

Аптамеры характеризуются малым размером — как правило, не более 60—80 нуклеотидов [12]. Моле­кулярная масса аптамера с длиной цепи ~60 нуклео­тидов менее 20 кДа — в 7.5 раз меньше, чем антитела (~150 кДа). Благодаря этому аптамеры имеют ряд преимуществ, таких как низкая иммуногенность [23] и лучшее проникновение в клетки [24]. Однако меньшие размеры осложняют применение аптаме- ров в аналитических методах, в частности в поляри­зационном флуоресцентном (ПФ) анализе.

Классический ПФ-анализ основан на конку­ренции между низкомолекулярным аналитом, содержащимся в пробе, и его производным, ме­ченным флуорофором, за взаимодействие с огра­ниченным количеством сайтов связывания ре­цептора (например, антитела или аптамера) [25]. Облучение реакционной смеси плоскополяризо- ванным светом приводит к тому, что флуорофор в свободном состоянии переизлучает деполяри­зованный свет, а в комплексе с рецептором его вращательная подвижность замедляется, и по­ляризация излучения становится выше (рис. 1а). На основании регистрируемой поляризации из­лучаемого света оценивается соотношение сво­бодного и связанного флуорофора и соответствен­но содержание аналита в пробе. Преимущества ПФ-анализа состоят в его одностадийном прове­дении с быстрыми диффузионно-независимыми взаимодействиями и возможности регистрации сигнала непосредственно в момент комплексообразования. Простота и экспрессность сделали данный метод востребованным для разнообраз­ных исследовательских и прикладных задач [25]. Однако подавляющее большинство разработок ПФ -анализа относится к применению антител. Для аптамеров прирост массы комплекса в резуль­тате реакции аналит—рецептор существенно мень­ше, что ухудшает чувствительность анализа.

 

Рис. 1. Поляризационный флуоресцентный анализ: а — общая схема, б — схема аптамерного анализа с использованием НЧЗ в качестве якорной струк­туры.

 

Ранее был предложен способ повышения чув­ствительности ПФ-аптамерного анализа, осно­ванный на включении аптамеров в комплексы с белками, так называемые якорные структуры [26]. С использованием комплексов биотинилированного аптамера со стрептавидином и конъ­югатом стрептавидин—IgG показано, что такой подход позволяет существенно снизить предел об­наружения. Затем включение аптамера в белковые комплексы для проведения ПФ-анализа было ре­ализовано на примере аденозинтрифосфатсвязывающего аптамера [27]. В [28] также использовали якорные структуры для ПФ-анализа пиретроидных инсектицидов с использованием наноантител. Однако белковые конъюгаты нельзя считать опти­мальными из-за вариабельности их стехиометрии и рисков агрегации.

В связи этим в данной работе предложен аль­тернативный вариант якорных структур для ПФ. Для этой цели наночастицы золота являются оп­тимальным выбором, обеспечивающим гомоген­ность и стабильность комплексов с аптамерами, а также простоту конъюгирования. Чтобы сохра­нить реакционноспособность конформации апта- мера, осуществляли его непрямую иммобилиза­цию: вначале на поверхности НЧЗ адсорбировали стрептавидин, а потом добавляли биотинилированный аптамер (рис. 1).

В качестве аналита использовали охратоксин А (ОТА), токсичный вторичный метаболит плес­невых грибов. Охратоксин А — повсеместно рас­пространенный контаминант продуктов питания (ячмень, пшеница, кукуруза, овес, сухофрукты, пряности и т.д.), вызывающий серьезные послед­ствия для здоровья человека [29]. Охратоксин А входит в число пищевых контаминант, кон­тролируемых законодательно на международном уровне [30], поэтому востребована разработка чув­ствительных и экспрессных методов его детекции в продуктах питания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты. Аналитические стандарты ОТА были приобретены в “Хромресурс” (Россия). Биотинилированный ДНК олигонуклеотид 5'-GAT— CGG—GTG—TGG—GTG—GCG—TAA—AGG— GAG-CAT—CGG-ACA-biotin 3' синтезирован и очищен фирмой “Синтол” (Россия). Стрептавидин, выделенный из Streptomyces avidinii, приоб­ретен у фирмы “Имтек” (Россия). Использовали сахарозу производства “ICN Biomedicals” (США), тетрахлораурат(Ш) водорода (ТХА), азид натрия, поливинилпирролидон, таниновую кислоту, бы­чий сывороточный альбумин (БСА) и цитрат на­трия — “Sigma-Aldrich” (USA). Белое сухое вино (урожая 2017 года, 12.5% алкоголя) приобретено в розничном магазине. Все реактивы, в том числе используемые в буферных растворах, степени чи­стоты не ниже ЧДА. Все растворы готовили с ис­пользованием воды, деионизированной с помо­щью системы MilliQ (“Millipore”, США).

Синтез наночастиц золота. НЧЗ диаметром ме­нее 10 нм получали в соответствии с методикой, описанной в [31], с модификациями. Все раство­ры реактивов предварительно фильтровали с по­мощью шприцевого фильтра Millex GS Filter Unit (“Merck”, США) с диаметром пор 0.22 мкм. К 79 мл деионизированной воды добавляли 1 мл 1%-ного ТХА, после чего раствор нагревали до 60°C. Рас­твор, содержащий 4 мл 1%-ного цитрата натрия, 0.5 мл 1%-ной таниновой кислоты, 0.5 мл 25 мМ K2CO3 и 15 мл деионизированной воды, также на­гревали до 60°C. Затем растворы смешивали и ки­пятили с обратным холодильником при переме­шивании в течение 30 мин. Полученный препарат НЧЗ хранили при 4—6°С без доступа света.

Синтез конъюгата НЧЗ—стрептавидин. В соот­ветствии с [32] рН полученного коллоидного рас­твора НЧЗ доводили до 10, после чего добавляли стрептавидин до концентрации 40 мкг/мл. Полу­ченный раствор инкубировали 1 ч при комнат­ной температуре без перемешивания, добавля­ли 100 мкг/мл БСА, инкубировали еще 15 мин при комнатной температуре и разделяли реак­ционную смесь на центрифуге Optima L-100XP (“Beckman Coulter”, Германия) при 73300 g в тече­ние 30 мин. Осадок конъюгата НЧЗ—стрептавидин перерастворяли в 10 мМ Трис-НО-буфере, содер­жащем 1% сахарозы, 0.03% азида натрия, pH 8.5. С помощью спектрофотометра Cary 300 UV-Vis (“Agilent Technologies”, США) измеряли спектр поглощения конъюгата. Полученный препарат хранили при 4°С без доступа света.

Характеристика наночастиц и их конъюгатов методом просвечивающей электронной микроскопии.

Размер и морфологию НЧЗ определяли с исполь­зованием просвечивающего электронного микро­скопа (Jeol CX-100, “Jeol”, Япония). Наночастицы золота наносили на покрытые формоваром медные сеточки (300 меш., “Pelco International”, США), сорбируя в течение 15 мин и затем удаляя изли­шек жидкости фильтровальной бумагой. Микро­скопию проводили при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении, равном 3.300.000—25.000.000. Полученные снимки переводили в цифровой фор­мат и анализировали с помощью программы UTH- SCSA Image Tool (University of Texas Health Science Center in San Antonio, США). Для построения ги­стограмм распределения частиц по размерам ис­пользовали программу OriginPro 9.1 (“Origin Lab”, США).

Характеристика наночастиц и их конъюгатов методом динамического рассеяния света. Измере­ния проводили при помощи прибора Zetasizer Nano ZSP (“Malvern Instruments”, Великобритания) с 4 мВ He—Ne-лазером (633 нм), угол светорас­сеяния 173°. В микрокюветы ZEN0040 (“Malvern Instruments”, Великобритания) помещали 150 мкл растворов наночастиц или их конъюгатов. Количе­ство повторов для каждого измерения составляло не менее 80. Индекс полидисперсности вычисляли как квадрат отношения стандартного отклонения к среднему значению диаметра.

Статистическую обработку результатов проводи­ли с помощью программного обеспечения Malvern 7.11 (“Malvern Instruments”, Великобритания).

Синтез конъюгатов: аптамер—стрептавидин— НЧЗ, ОТА-4’-(аминометил)флуоресцеин. Исход­ный раствор 3’-биотинилированного аптамера с концентрацией 400 мкМ использовали для при­готовления 12 мкМ раствора в 10 мМ Трис-HCl- буфере, рН 8.5; 20 мкл этого раствора смешивали с 2 мл конъюгата НЧЗ—стрептавидин с концен­трацией 12.5 нМ по НЧЗ и A520 = 0.87. Конечная концентрация аптамера составила 600 нМ, а моль­ное соотношение аптамер : НЧЗ — 48 : 1. Реаген­ты инкубировали при комнатной температуре и интенсивном перемешивании в течение часа. Несвязавшийся аптамер отделяли с использовани­ем центриконов AmiconUltra (“Millipore”, США) с мембраной 100 кДа. Для этого в центрикон по­мещали 500 мкл препарата и проводили центрифу­гирование при 4500 g в течение 10 мин.

Конъюгат OTA-4' - (аминометил) флуоресцеин (ОТА—Флу) синтезировали и очищали с помощью метода тонкослойной хроматографии в соответ­ствии с методикой, приведенной в [26]. По кали­бровочной зависимости ПФ ОТА—Флу от концен­трации аптамера в буфере ТБ (20 мM Трис-HCl; 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl и 20 мМ CaCl2, pH 8.5) определяли концентрацию несвязавшегося апта- мера. Осадок, содержащий конъюгат, перераство- ряли в 10 мМ Трис-НО-буфере, содержащем 1% сахарозы, 0.03% азида натрия, рН 8.5, и повторно отделяли несвязавшийся аптамер. Для дальней­шей работы А520 полученного конъюгата аптамер- стрептавидин-НЧЗ доводили до 2 единиц.

Измерение флуоресценции или поляризации флу­оресценции. В лунки 96-луночного черного ми­кропланшета добавляли 100 мкл разведенных в ТБ аптамера (от 6 мкМ до 6 нМ), конъюгата НЧЗ-стрептавидин (А520 от 2 до 0.03) или конъ­югата НЧЗ-стрептавидин-аптамер (А520 от 2 до 0.03) и 100 мкл ОТА-Флу (8 нМ). Микропланшет встряхивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Для конъюгата НЧЗ-стрептавидин измеряли флуоресценцию, а для аптамера и конъ­югата НЧЗ-стрептавидин-аптамер — ПФ (при экстинкции 485 нм и эмиссии 535 нм). Измерения проводили с помощью мультифункционального планшетного ридера Zenyth 3100 (“AnthosLabtecInstruments”, Австрия), время интеграции состав­ляло 1 с, G-фактор — 62. Значение разности по­ляризации флуоресценции определяли как

ΔmP = mPb — mPf,

где mPf и mPb — ПФ несвязанного и связанного со­стояния ОТА-Флу соответственно.

Поляризационный флуоресцентный аптамерный анализ проводили в 96-луночных черных микро­планшетах. Готовили разведения охратоксина А в ТБ с концентрациями от 20 мкМ до 0.8 нМ. В лунку микропланшета переносили по 50 мкл раствора ОТА, добавляли 100 мкл 8 нМ раствора ОТА-Флу и 50 мкл раствора рецептора (800 мкМ аптамера либо 160 нМ конъюгата аптамер-стреп- тавидин-НЧЗ).

Для определения ПФ, соответствующей нуле­вой концентрации аптамера, использовали смесь 50 мкл раствора ОТА-Флу и 150 мкл ТБ. Для опре­деления ПФ, соответствующей полному переходу ОТА-Флу в комплекс с аптамером, использовали смесь 50 мкл раствора ОТА-Флу, 50 мкл раствора рецептора и 100 мкл ТБ. Микропланшеты встря­хивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. После этого измеряли ПФ и строи­ли сигмоидную зависимость ПФ от концентрации ОТА в полулогарифмических координатах с ис­пользованием программного обеспечения Origin- Pro 9.1 (“Origin Lab”, США). Предел обнаружения определяли как концентрацию ОТА, при кото­рой происходит 10%-ное вытеснение ОТА-Флу из комплекса с аптамером [33].

Определение ОТА в вине. Подготовку проб бело­го сухого вина проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [26]. В пробы вносили ОТА, его финальное содержание варьировалось от 3 мкМ до 4 нМ. Анализ проб проводили соглас­но приведенной выше методике ПФ-аптамерного анализа, используя их вместо раствора ОТА в бу­фере. Отрицательный контроль — 50 мкл ОТА- Флу, 50 мкл рецептора и 100 мкл вина, положи­тельный контроль — 50 мкл ОТА-Флу, 50 мкл буфера и 100 мкл вина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 

При выборе размеров якорных структур ру­ководствовались расчетами вращательной под­вижности молекул в растворе, основанными на уравнении Перрена для жесткой сферы [34] и представленными в [26].

Из проведенного анализа следует, что моле­кулярные массы комплекса флуорофор-аналит- рецептор-носитель от 200 кДа обеспечивают при работе с флуоресцеином (время полужизни возбужденного состояния — 4 нс) максимальное торможение вращения метки и соответственно максимальную разницу в поляризации флуорес­ценции между свободным и связанным состояни­ем меченого аналита.

Данная масса достигается даже при работе с НЧЗ малых размеров. Так, масса сферической НЧЗ диаметром 10 нм, вычисляемая по ее раз­мерам и плотности золота, равна 6000 кДа. Мас­сой в 200 кДа характеризуются НЧЗ диаметром 3.2 нм, но разделение конъюгатов с НЧЗ диаме­тром 5-6 нм и менее требует использования вы­сокоскоростных центрифуг. Увеличение диаметра сопровождается снижением суммарной площади поверхности наночастиц в коллоидном растворе той же оптической плотности и соответственно со­пряжено с негативными последствиями поглоще­ния света наночастицами-носителями. Поэтому для реализации якорного усиления были выбраны НЧЗ диаметром около 10 нм.

Метод получения НЧЗ с такими размерными характеристиками основан на восстановлении тетрахлораурата цитратом в присутствии таниновой кислоты [31]. Для характеристики полученного препарата использовали просвечивающую элек­тронную микроскопию (ПЭМ) и регистрацию ди­намического рассеяния света (ДРС).

На рис. 2а представлена электронная микро­фотография препарата НЧЗ. Видно, что НЧЗ име­ют форму, близкую к сферической. В результате проведенной обработки изображений наночастиц и статистического анализа полученных данных построено распределение НЧЗ по диаметру — рис. 2б. Средний диаметр частиц — 8.7 ± 1.4 нм, индекс полидисперсности — 0.225, что отражает узкое распределение наночастиц по размерам [35].

 

Рис. 2. Размерная характеристика НЧЗ: а — элек­тронная микрофотография, б — распределение НЧЗ по диаметру по данным ПЭМ; n = 105, в — рас­пределение НЧЗ по гидродинамическому диаметру по данным ДРС.

 

При измерении ДРС (рис. 2в) охарактеризова­ны размеры частиц, включая их гидратную обо­лочку. В связи с особенностями данного метода полученный средний гидродинамический диаметр НЧЗ составил 13 нм, т.е. был существенно больше, чем для ПЭМ, учитывающей только размеры элек­тронноплотного «ядра». Индекс полидисперсно­сти частиц составлял 0.27.

Полученные НЧЗ использовали для адсорб­ционной иммобилизации молекул стрептавидина и последующего связывания биотинилиро- ванного аптамера. Концентрации стрептавидина и аптамера выбирали таким образом, чтобы обе­спечить максимальное насыщение поверхности. Менее плотное покрытие НЧЗ нецелесообразно, так как в этом случае увеличивается концентра­ция НЧЗ в растворе и негативное влияние частиц на анализ, обусловленное поглощением ими воз­буждающего и испускаемого света [36].

Теоретический расчет, основанный на пред­положении о максимально плотном покрытии поверхности НЧЗ молекулами стрептавидина и сохранении реакционной способности всеми че­тырьмя биотинсвязывающими сайтами белка, дает мольное соотношение НЧЗ : стрептавидин : апта- мер, равное 1 : 7 : 28. Использованное при синте­зе соотношение НЧЗ-стрептавидин составляло 1 : 60.

Из полученных спектров поглощения НЧЗ и конъюгата НЧЗ-стрептавидин (рис. 3а) следу­ет, что НЧЗ и конъюгат обладают выраженными максимумами поглощения при 520 и 525 нм. По­скольку НЧЗ поглощают свет в области эмиссии флуоресцеина, необходимо определить условия, в которых этот процесс не ухудшает характеристи­ки анализа. Установленная зависимость регистри­руемой флуоресценции ОТА-Флу от содержания присутствующего в реакционной среде конъю­гата НЧЗ-стрептавидин представлена на рис. 3б. Как видим, присутствие НЧЗ с оптической плот­ностью более 0.2 приводит к неспецифическому тушению флуоресценции метки, отрицательно сказываясь на точности измерения ПФ. В свя­зи с этим использование больших концентраций НЧЗ нецелесообразно.

 

Рис. 3. Характеристика оптических свойств конъюгата НЧЗ—стрептавидин: а — сравнение нормализованных спек­тров поглощения НЧЗ (1) и конъюгата НЧЗ—стрептавидин (2), б — зависимость флуоресценции ОТА—Флу (длины волн экстинкции/эмиссии 485/535 нм) от оптической плотности конъюгата НЧЗ—стрептавидин при 520 нм; n = 3.

 

При синтезе конъюгата аптамер-стрепта- видин-НЧЗ для обеспечения максимально­го насыщения поверхности была взята кон­центрация аптамера, существенно ббльшая по отношению к содержанию центров связыва­ния биотина в конъюгате стрептавидин—НЧЗ, т.е. при синтезе концентрация аптамера составляла 600 нМ, а потенциальных сайтов связывания — 350 нМ (концентрация НЧЗ — 12.5 нМ; каждая наночастица имеет семь иммобилизованных мо­лекул стрептавидина и соответственно 28 сайтов связывания аптамера).

Для оценки фактического связывания апта- мера при синтезе вычисляли разность между его исходной концентрацией и содержанием в надо- садке после отделения конъюгата. Для этих рас­четов использовали величины ΔmP, регистри­руемые при добавлении ОТА—Флу к над осадку, разведенному в ТБ в 2, 4, 8 и 16 раз, выделенные красным цветом на рис. 4а. Для определения кон­центрации аптамера в надосадке строили кали­бровочную кривую зависимости ΔmP от концен­трации аптамера (рис. 4а, черный пунктир). Далее величины ΔmP, полученные для надосадка, с уче­том разведения подставили в четырехпараметри­ческое уравнение, полученное аппроксимацией калибровочной зависимости. Усреднив получен­ные значения для разных разведений, определили концентрацию аптамера в надосадке. Она соста­вила 432 ± 54 нМ. С учетом общей концентрации аптамера при синтезе (600 нм) концентрация ап­тамера, связавшегося с НЧЗ, — 168 нМ. Согласно проведенным расчетам на одной НЧЗ находится 13—14 молекул аптамера, что соответствует уча­стию в связывании биотина двух сайтов стрепта- видина из четырех.

 

Рис. 4. Характеристика связывания конъюгата аптамер—стрептавидин—НЧЗ: а — зависимости ПФ конъюгата от концентрации аптамера (черная кривая) и ПФ надосадка, содержащего несвязавшийся аптамер, от его разведе­ния (красные точки), б — зависимости изменения ПФ ОТА—Флу (концентрация 4 нМ) от концентраций аптамера в свободном состоянии (1) и в составе конъюгата аптамер—стрептавидин—НЧЗ (2); n = 3.

 

Чтобы выбрать концентрацию аптамерного конъюгата для проведения конкурентного экс­перимента и показать, что включение аптамера в комплексы вызывает рост ПФ, сравнили зави­симости ΔmP при фиксированном содержании ОТА-Флу от концентраций свободного аптамера и аптамера, содержащегося в конъюгате. Из рис. 4б следует, что включение аптамера в комплекс ведет к увеличению ПФ. При выборе концентраций ап- тамера и его конъюгата руководствовались тем, что чувствительность конкурентного анализа тем ниже, чем меньше используемая концентрация ре­цептора [37]. С учетом обеспечения необходимой достоверности результатов для построения конку­рентных зависимостей выбрано разведение конъ­югата НЧЗ-стрептавидин—аптамер с А520 = 0.25, соответствующее концентрации аптамера 40 нМ. Для анализа с исходным аптамером использовали его концентрацию, равную 200 нМ.

Зависимость ПФ ОТА-Флу от концентрации ОТА в конкурентном анализе построили с ис­пользованием НЧЗ в качестве якоря для аптамера и сопоставили ее с аналогичной зависимостью для нативного аптамера (рис. 5). Хотя при опти­ческой плотности 0.25 наблюдается 20%-ное сни­жение интенсивности флуоресценции (рис. 3б), это не препятствовало достоверному определе­нию содержания ОТА. Согласно рис. 5 для ана­лиза с конъюгатом аптамера предел определения ОТА равен 5.1 ± 0.6 нМ (2.06 ± 0.24 мкг/кг), тогда как для анализа со свободным аптамером эта вели­чина составляет 35.0 ± 5.2 нМ (14.1 ± 2.0 мкг/кг).

 

Рис. 5. Конкурентные зависимости ПФ-аптамерного определения ОТА с использованием комплекса аптамер—стрептавидин—НЧЗ (1) и свободного аптаме­ра (2); n = 2.

 

Согласно нормативам Европейского союза пре­дельно допустимая концентрация ОТА в продуктах питания варьирует от 0.5 до 50 мкг/кг [30]. Согласно российским нормативам (СанПиН 2.3.2.1078— 01) предельно допустимая концентрация ОТА составляет 5 мкг/кг. Это говорит о потенциальной пригодности разработанной методики для практического применения.

Сопоставляемые методики ПФ-аптамерного анализа с якорным усилением и без него были при­менены для выявления ОТА в пробах белого вина. Выбор объекта исследования обусловлен частой контаминацией винограда и винодельческой про­дукции охратоксином А [38, 39]. Для пробоподготовки использовали выбранную ранее [26] мето­дику двухстадийного обесцвечивания с помощью поливинилпирролидона, которая удаляет полифе­нолы и другие компоненты матрикса, мешающие проведению анализа.

Полученные концентрационные зависимости ПФ-аптамерного анализа для проб вина приведе­ны на рис. 6. Пределы обнаружения ОТА в вине составили 139 ± 25 нМ (56 ± 10 мкг/кг) для анали­за с использованием свободного аптамера и 5.6 ± 2.2 нМ (2.3 ± 9 мкг/кг) при использовании якорной структуры стрептавидин—НЧЗ. Таким образом, достигнут 25-кратный выигрыш в чув­ствительности. Отметим близость достигнутого предела детекции с характеристикой ранее опи­санного анализа с белковыми якорными структу­рами (1.1 мкг/мл) [26].

 

Рис. 6. Конкурентные зависимости ПФ-аптамерного анализа ОТА с использованием конъюгата аптамер—стрептавидин—НЧЗ (1) и биотинилированного аптамера (2) в качестве рецептора в пробах белого вина; n = 4.

 

Разработанный метод обеспечивает выявление ОТА в вине вплоть до концентрации в пределах ошибки, соответствующей предельно допустимой концентрации ОТА в вине — 2 мкг/кг [30]. Важ­ными достоинствами разработанного метода яв­ляются его экспрессность — время анализа 15 мин и простота проведения — одностадийное взаимо­действие без необходимости разделения компо­нентов реакционной среды или добавления допол­нительных реагентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенный метод анализа с использова­нием наночастиц золота как якорных структур обеспечивает существенное (25-кратное) сни­жение предела детекции и возможность кон­троля контаминации белого вина охратоксином А в соответствии с нормативными требованиями к безопасности продукции. Разработанный подход универсален и может быть применен для поляри­зационного флуоресцентного аптамерного анали­за других низкомолекулярных соединений.

Об авторах

А. В. Самохвалов
Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
Россия
Москва


И. В. Сафенкова
Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
Россия
Москва


С. А. Еремин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Россия
Москва


А. В. Жердев
Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
Россия
Москва


Б. Б. Дзантиев
Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
Россия
Москва


Список литературы

1. Dykman L., Khlebtsov N. // Chem. Soc. Rev. 2012. V. 41. № 6. P. 2256. https://doi.org/10.1134/S1995078013020092.

2. Elahi N. , Kamali M., Baghersad M.H. // Talanta. 2018. V. 184. P. 537. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2018.02.088.

3. Navarro J.R.G., Lerouge F. // Nanophotonics. 2017. V. 6. № 1. P. 71. https://doi.org/10.1515/nanoph-2015-0143.

4. Хлебцов Б.Н., Ханадеев В.А., Панфилова Е.В. и др. // Российские нанотехнологии. 201 2. Т. 7. № 11–12. С. 87. https://doi.org/10.1134/S1995078013020092.

5. Malmsten M. // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2013. V. 18. № 5. P. 468. https://doi.org/10.1016/j.cocis.2013.06.002.

6. Doria G., Conde J., Veigas B. et al. // Sensors. 2012. V. 12. № 2. P. 1657. https: //doi.org/10.3390/s120201657.

7. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н. // Российские нанотехнологии. 2007. Т. 2. № 3–4. С. 69.

8. Rosi N.L., Mi rki n C.A. // Chem Rev. 2005. V. 105. № 4. P. 1547. https://doi.org/10.1021/cr030067f.

9. Mirkin C.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J. // Nature. 1996. V. 382. № 6592. P. 60 7. https://doi.org/10.1038/382607a0.

10. Ellington A.D., Szostak J.W. // Nature. 1992. V. 355. № 6363. P. 850. https://doi.org/10.1038/355850a0.

11. Kong H.Y., Byun J. // Biomol. Ther. 2013. V. 21. № 6. P. 423. http://dx.doi.org/10.4062/biomolther.2013.085.

12. McKeague M., McConnell E.M., Cruz-Toledo J. et al. // J. Mol. Evol. 2015. V. 81. № 5–6. P. 150. https://doi.org/10.1007/s00239-015-9708-6.

13. Nakamura Y. // Nucleic Acid Drugs / Ed. Murakami A. Heidelberg: Springer-Verlag, 2012. P. 135. https://doi.org/10.1007/978-3-642-304 63-7.

14. Xu J.J., Li L.L., Shi H. et al. // Inorg. Chem. Commun. 2019. V. 107. P. 107456. https://doi.org/10.1016/j.inoche.2019.107456.

15. Kim D., Jeong Y.Y., Jon S. // ACS Nano. 2010. V. 4. № 7. P. 3689. https://doi.org/10.1021/nn901877h.

16. Medley C.D., Smith J.E., Tang Z. et al. // Anal. Chem. 2008. V. 80. № 4. P. 1067. https://doi.org/10.1021/ac702037y.

17. Wei H., Li B., Li J. et al. // Chem. Commun. 2007. № 36. P. 3735. http://dx.doi.org/10.1039/b707642h.

18. Wu Y.Y., Huang P., Wu F.Y. // Food Chem. 2020. V. 304. Article 125377. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125377.

19. Wang W., Chen C., Qian M., Zhao X.S. // Anal. Biochem. 2008. V. 373. № 2. P. 213. https: //doi.org/10.1016/j.ab.2007.11.013.

20. Wang J., Shan Y., Zhao W.W. et al. // Anal. Chem. 2011. V. 83. № 11. P. 4004. https://doi.org /10.1021/ac200616g.

21. Wang R.H., Zhu C.L., Wang L.L. et al. // Talanta. 2019. V. 205. Article 120094. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.06.094.

22. Liu Z. , Wang H. // Analyst. 2019. V. 144. № 19. P. 5794. https://doi.org/10.1039/c9an01430f.

23. Morita Y., Leslie M., Kameyama H. et al. // Cancers. 2018. V. 10. № 3. Article 80. https://doi.org/10.3390/cancers10030080.

24. Zhou J., Rossi J. // Nat. Rev. Drug Discov. 2017. V. 16. № 3. P. 181. https://doi.org/10.1038/nrd.2016.199.

25. Zhang H.Y., Yang S.P., De Ruyck K. et al. // TRAC — Trends Anal. Chem. 2019. V. 114. P. 293. https ://doi.org/10.1016/j.trac.2019.03.013.

26. Samokhvalov A.V., Safenkova I.V., Eremin S.A. et al. // Anal. Chim. Acta. 2017. V. 962. P. 80 . https://doi.org/10.1016/j.aca.2017.01.024.

27. Li Y., Sun L., Zhao Q. // Talanta. 2017. V. 174. P. 7. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2017.05.077.

28. Wang Y., Li Z., Barnych B. et al. // J. Agric. Food Chem. 2019. V. 67. № 41. P. 11536. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b04621.

29. Tao Y., Xie S., Xu F. et al. // Food Chem. Toxicol. 2018. V. 112. P. 320. https://doi.org/10.1016/j.fct.2018.01.002.

30. Commission Regulation (EC) № 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs (OJ L 364, 20.12.200 6, p. 5).

31. Philip D. // Spectrochim. Acta A. 2008. V. 71. № 1. P. 80. https://doi.org/10.1016/j.saa.2007.11.012.


Просмотров: 44


ISSN 1992-7223 (Print)