Preview

Российские нанотехнологии

Расширенный поиск

Оценка гемосовместимости наноструктурированных сфер гидроксиапатита различного размера

https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-7-8-100-105

Полный текст:

Аннотация

Синтетический наноструктурированный гидроксиапатит перспективен для широкого спектра задач восстановительной медицины и имплантологии, а также в косметологии и стоматологии. Меняя условия синтеза, для каждого конкретного направления применения можно регулировать характеристики материала в соответствии с поставленной задачей. Методом химического осаждения с последующей распылительной сушкой с ультразвуковой обработкой получены образцы наноструктурированного гидроксиапатита с различным составом и размером гранул. Анализ гемосовместимости материалов в экспериментах с мононуклеарными лейкоцитами и эритроцитами крови мыши показал, что полученные образцы гранул в концентрации 40 мг на 2 мл клеточной взвеси являются гемосовместимыми по всем исследуемым показателям независимо от размера и состава сфер.

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия во всем мире ведутся поиски биосовместимых материалов с целью ис­пользования их в травматологии, ортопедии и сто­матологии. В клиническую практику внедрены импланты из керамики, биополимеров, металлов, углеродсодержащих и композитных материалов. Искусственный материал, замещающий кость, по своим физико-химическим и биологическим свойствам должен приближаться к нормальной костной ткани, быть остеосовместимым, способ­ствовать оптимальному течению репаративных процессов. 

К наиболее распространенным биосовмести- мым материалам с ярко выраженными показате­лями биоактивности относятся искусственный и натуральный гидроксиапатит. В настоящее вре­мя для замещения костных дефектов в хирургиче­ской стоматологии, ортопедии и травматологии используется много различных форм гидроксиапа­тита, различающихся по форме и величине частиц. Считается, что синтетический гидроксиапатит по химическому составу и кристаллографическим показателям практически идентичен гидроксиапатиту нативной кости [1—3].

Актуальной задачей при получении новых ма­териалов на основе наногидроксиапатита является обеспечение возможности контролировать соот­ношения гидроксиапатита и фосфатов кальция, что позволит регулировать растворимость перспек­тивного импланта от быстрорастворимого до нерас­творимого (тетрафосфат кальция > α-трикальций фосфат > дигидрат дикальций фосфата > безво­дный дикальций фосфат ~ октокальций фосфат > β-трикальций фосфат > гидроксиапатит). Это по­зволит для каждого конкретного направления при­менения управлять характеристиками материала в соответствии с поставленной задачей. Например, при создании импланта нативная костная ткань будет замещать саморастворяющийся имплант с заданной скоростью или он будет стационарным в организме. Кроме того, порошок с контролируе­мыми составом, морфологией и размерами частиц отлично подходит для аддитивной печати [9, 10], дерматологии [11] и косметологии [12, 13].

Целью настоящей работы было получение об­разцов частиц нанокристаллического гидрок- сиапатита с изменяемыми размером и составом гранул и проведение оценки гемосовместимости полученных материалов на клетках крови мыши с помощью тестов на способность мононуклеар- ных лейкоцитов окислять формазан и на индуци­рованный гемолиз эритроцитов. Выбор параме­тров оценки безопасности наногидроксиапатита осуществлялся в связи с перспективой примене­ния полученных образцов в составе имплантов, контактирующих с внутренней средой организ­ма, прежде всего с кровью. Процедура исследо­вания гемотоксичности наноматериалов прово­дилась с учетом соответствующих методических указаний Роспотребнадзора РФ [9] и требований национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-4­2009 [10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе анализировались образцы наноструктурированного гидроксиапатита (hydroxyapatite granular (HAPG)) с характерным размером гранул 5-25, 25-45 и 40-125 мкм (HAPG-5-25, HAPG- 25-45, HAPG-40-125).

Гидроксиапатит был получен методом химиче­ского осаждения при величине pH, равной 11, тем­пературе T — 65°C, времени осаждения — 120 мин, концентрация исходных реагентов — 10 мас. %. Исходными реагентами являлись нитрат кальция Ca(NO3)2, гидрофосфат аммония (NH4)2HPO4 и ги­дроксид аммония NH4OH. Далее суспензии рас­пылялись на распылительной сушилке Mini Spray Dryer B-290, оснащенной пневматической фор­сункой, при температуре 220°С и давлении 150 атм (табл. 1).

 

Таблица 1. Параметры синтеза и гранулометрический состав полученных образцов

Образец

Скорость подачи, мл/мин

Мощность ультразвука, Вт

T, °С

d, мкм

HAPG-5-25

30

7

220

20

HAPG-25-45

30

3.5

220

40

HAPG-40-125

15

7

220

100

Для исследования морфологии гидроксиапатитов, полученных при разных условиях синтеза, был выбран метод сканирующей электронной микро­скопии (СЭМ). Анализ проводили с использова­нием сканирующего электронного микроскопа “Tescan Vega 3” (Чехия).

Исследование плотности образцов проводили с использованием гелиевого ультрамикропикно­метра Quantachrome 1000. Десорбцию проводили в вакууме, время измерения составляло 2 ч.

Измерение удельной поверхности и пористости образцов гидроксиапатитов проводили с исполь­зованием анализатора площади поверхности и раз­меров пор Nova 1200e (Quantachrome). Дегазацию образцов проводили в течение 12 ч при температу­ре 250°С.

С целью стерилизации образцы материалов выдерживали в течение ночи в 70°-ном этиловом спирте, далее образцы помещали в стерильные пластиковые чашки Петри и высушивали в усло­виях стерильной атмосферы внутри ламинарного шкафа.

Для получения мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) и эритроцитов использовали кровь мышей линии Bl/6c, собранных в пробирку с антикоагу­лянтом (ЭДТА) после рассечения сонных артерий животных. Стабилизированную кровь суспен­дировали в среде RPMI-1640 в соотношении 1:3. В центрифужные пробирки разливали фиколл- урографин по 2 мл, на него наслаивали разведен­ную кровь. Пробирки центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин, 20°С на центрифуге с бакет-ротором Juane, Франция. После этой процедуры МЛ формировали кольцо на границе фаз кровь-фиколл, а эритроциты формировали осадок. Для по­лучения стандартизированной взвеси МЛ и эри­троцитов использовали общепринятые методики [11]. Стандартизированная суспензия МЛ содер­жала 5.07 · 104 кл/мл, суспензия эритроцитов со­держала 8.4 · 107 кл/мл.

Для анализа гемосовместимости образцов гидроксиапатита на МЛ исходную суспен­зию МЛ разливали по 2 мл в лунки 24-луноч- ного планшета, содержащие 40 мг гидрок- сиапатита, и инкубировали в течение одних суток в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и темпе­ратуре 37° С. В качестве контроля использова­ли интактную суспензию МЛ. Количественную оценку проводили с использованием МТТ- колориметрического теста [13—15].

Оценку индуцированного гемолиза проводили с использованием колориметрии, оценивая выход гемоглобина во внеклеточную среду в результате лизиса эритроцитов после контакта с испытуемы­ми образцами. Для этого в лунки планшета с об­разцами материалов (m = 40 мг) добавляли по 2 мл стандартизированной взвеси эритроцитов.

Оптическую плотность (ОП) оценивали на планшетном ридере Multiscan MS (Labsystems, Финляндия) в 96-луночном планшете при длине волны 540 нм, измеряя экстинкцию раствора ге­моглобина в физиологическом растворе хлорида натрия против фоновых значений экстинкции фи­зиологического раствора.

Анализ зависимости относительного уровня гемолиза от ОП раствора гемоглобина проводи­ли графическим способом с применением модуля “Графики блока данных” пакета программ стати­стического анализа Statistica 6.0, StatSoft, модули “Базовая статистика/Таблицы”. Для построения целевого графика использовали данные ОП интактного контроля (отсутствие гемолиза), контро­ля 100%-ного гемолиза, а также нескольких проме­жуточных значений (рис. 1).

 

Рис. 1. Зависимость индуцированного гемолиза от оптической плотности.

 

Образцы оценивали как гемосовместимые при значении индуцированного гемолиза, не пре­вышающем 2 ± 0.3%, с учетом существующих ре­комендаций [10], а также результатов сходных ис­следований [15].

Статистический анализ. Результат описатель­ного анализа первичных данных представлен в формате: среднее выборочное (χ) ± величина стандартной девиации. Межгрупповой сравни­тельный статистический анализ проводили с ис­пользованием χ2 (при этом значение суммарной выборки N = 30, число членов в каждой группе f = 5), сравнение расчетных показателей с предельными рекомендуемыми — с помощью мето­да ANOVA с использованием пакета программ Statistica 6.0, StatSoft. Различия считали достовер­ными прир < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеризация материала. Исследование морфологии было проведено на финальном эта­пе синтеза — после обработки в распылительной сушке. При получении гидроксиапатита методом химического (жидкофазного) осаждения его фор­ма имеет игловидный характер. Но при обработке полученной суспензии ультразвуком и распылительной сушкой гидроксиапатит образует доволь­но крупные агрегаты наночастиц сферической формы (рис. 2). Размер этих сфер варьируется в зависимости от параметров распылительной су­шилки.

 

Рис. 2. СЭМ-изображения (а, в, д) и гранулометрический состав (б, г, е) образцов HAPG- 5—25, HAPG-25-45 и HAPG-40—125 соответственно.

 

На рис. 2 приведены микрофотографии об­разцов гранул гидроксилапатита HAPG-5—25, HAPG-25—45 и HAPG-40—125. На микрофото­графиях видно, что все образцы гранул имеют сферическую форму (рис. 2а, 2в, 2д), однако в за­висимости от метода распыления различный гра­нулометрический состав, как показано на рис. 2б, 2г, 2е. Гранулометрический состав образца HAPG- 5—25 соответствует 5-25 мкм. Количество частиц менее 5 мкм составляет менее 2 об. %. Распределе­ние гранул по размерам образца HAPG-25-45 со­ответствует интервалу 25-45 мкм и находится в интервале 20-50 мкм, 5% меньше 25 мкм и 15% больше 45 мкм, что укладывается в ошибку опре­деления гранулометрического состава дифракци­онными методами. Гранулометрический состав образца HAPG-40-125 соответствует диапазону 40-125 мкм и находится в интервале 40-130 мкм, 5 об. % больше 125 мкм, что также укладывается в ошибку определения гранулометрического соста­ва дифракционными методами. Отметим, что все образцы имеют распределение гранул по разме­рам, близкое к монодисперсному.

Результаты определения пикнометрической плотности и удельной поверхности полученных образцов представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Значения пикнометрической плотности и удельной поверхности образцов гидроксиапатита

Образец

Пикнометрическая плотность, г/см3

Удельная поверхность, м2

HAPG-5-25

2.95 ± 0.31

120 ± 1.1

HAPG-25-45

2.86 ± 0.42

110 ± 1.8

HAPG-40-125

2.79 ± 0.28

94 ± 1.9

Теоретические значения плотности гидроксиа- патита находится в интервале 3.14-3.21 г/см3. По­добное отклонение от теоретической плотности может быть связано как с наличием закрытой по­ристости в полученных образцах гидроксиапатита, так и с наличием примесей, обладающих меньшей плотностью.

Предложенные методы позволяют синтезиро­вать гидроксиапатит с различной морфологией и значением удельной поверхности в пределах от 94 до 120 м2/г, что может найти применение в различных биомедицинских приложениях.

Оценка гемосовместимости. В ходе проведен­ного теста на способность МЛ окислять формазан получены данные, приведенные на рис. 3.

 

Рис. 3. Оптическая плотность раствора формазана, восстановленного МЛ после коинкубации с исследу­емыми материалами и в интактном контроле (р < 0.05).

 

Анализ результатов показал, что ОП контроль­ных растворов находилась в пределах 0.172 ± 0.04 отн. ед. Для опытных вариантов средние значе­ния составили 0.165 ± 0.029, 0.152 ± 0.027 и 0.161 ± 0.027 отн. ед. соответственно. Проведенный срав­нительный статистический анализ показал недосто­верность различий экстинкции растворов в лунках с испытуемыми образцами и в интактном контроле, что свидетельствует о гемосовместимости образцов гидроксиапатита по данному параметру.

Проведенные измерения экстинкции раство­ров гемоглобина в физиологическом растворе опытных проб и нулевого контроля с дальнейшим описательным анализом полученных первичных данных, обобщающим величину ОП в лунках с опытными образцами и контролем, приведены на рис. 4.

 

Рис. 4. Распределение показателей индуцированно­го гемолиза в контрольных пробах и после коинку­бации с пробами гидроксиапатита (р < 0.05).

 

Приведенные результаты показывают, что ин­тенсивность индуцированного гемолиза испыту­емыми образцами материалов достоверно не от­личалась от контрольного значения. Основываясь на этом, можно сделать вывод, что исследуемые образцы гидроксиапатита по данному показателю могут быть отнесены к биосовместимым и в даль­нейшем могут рассматриваться как пригодные для медицинского применения.

Таким образом, в ходе работ получены три об­разца наноструктурированного гидроксиапатита с характерным размером гранул 5-25, 25-45 и 40-125 мкм, с различной морфологией и зна­чениями удельной поверхности. Анализ гемосов­местимости материалов в экспериментах с МЛ и эритроцитами крови мыши показал, что полу­ченные образцы гранул в концентрации 40 мг на 2 мл клеточной взвеси являются гемосовме- стимыми по всем исследуемым показателям неза­висимо от размера и состава сфер. Эти результаты согласуются с данными других исследований ге­мосовместимости наногидроксиапатитов, полу­ченных различными методами. Например, в [15] гидротермальным методом были получены образ­цы нанопористого гидроксиапатита, гемосовме­стимость которого определяли с помощью тестов на гемолиз, адгезию тромбоцитов, активацию тромбоцитов и измерения времени свертывания крови. Уровень гемолиза был менее 5%, что сви­детельствует о высокой гемосовместимости об­разцов. Не наблюдалось активации и морфологических изменений тромбоцитов, прилипших к гидроксиапатиту. Кроме того, не было найде­но различий с контролем во времени свертыва­ния крови после инкубации с гидроксиапатитом. В [16] были исследованы образцы гидроксиапатит-алюминиевых нанокомпозитов, полученных с помощью микроволнового излучения. Гемоли­тическая оценка показала приемлемую гемосов­местимость для различных концентраций всех исследованных образцов. Анализ клеточной про­лиферации на линиях остеобластов Saos-2 пока­зал, что нанокомпозиты на основе гидроксиапатита и алюминия улучшают пролиферацию.

Полученные в исследовании результаты могут быть использованы при разработке материалов и препаратов биомедицинского назначения на ос­нове наногидроксиапатита.

Об авторах

О. В. Захарова
Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина; Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Россия

392000, г. Тамбов, ул. Интернациональная, 33

119049, г. Москва, Ленинский проспект, 4



И. А. Васюкова
Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина
Россия

392000, г. Тамбов, ул. Интернациональная, 33



А. А. Гусев
Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина; Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Россия

392000, г. Тамбов, ул. Интернациональная, 33

119049, г. Москва, Ленинский проспект, 4



К. О. Чупрунов
Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Россия

119049, г. Москва, Ленинский проспект, 4



А. Г. Юдин
Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Россия

119049, г. Москва, Ленинский проспект, 4



Д. В. Кузнецов
Национальный исследовательский технологический университет “МИСиС”
Россия

119049, г. Москва, Ленинский проспект, 4



Список литературы

1. Vallet-Regi M. Biomimetic Nanoceramics in Clinical Use: From Materials to Applications. Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK. 1st edition, 2008. 185 p.

2. LeGeros R.Z. // Chem. Rev. 2008. V. 108. № 11. P. 4742.

3. Zakharov N.A., Polunina I.A., Polunin K.E. et al. // Inorganic Materials. 2004. V. 40. № 6. P. 641.

4. Liu Z., Liang H., Shi T. et al. // Ceramics International. 2019. V. 45. № 8. P. 11079.

5. Shao H., He J., Lin T. et al. // Ceramics International. 2019. V. 45. № 1. P. 1163.

6. Sliem M.A., Karas R.A., Harith M.A. // J. Photochem Photobiol. B. 2017. V. 173. P. 661. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2017.07.004.

7. Coelho C.C., Grenho L., Gomes P.S. et al. // Sci Rep. 2019. V. 9. P. 11050.

8. Ramis J.M., Coelho C.C., Cуrdoba A. et al. // Cosmetics. 2018. V. 5. № 3. P. 53.

9. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов: Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 122 с.

10. ГОСТ Р ИСО 10993-4-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью.

11. Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью. Москва, 1991.

12. Ciapetti G., Cenni E., Pratelli L., Pizzoferrato A. // Biomaterials. 1993. V. 14. № 5. P. 359.

13. ISO 10993–5:2009 Biological evaluation of medical devices. Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.

14. Szymonowicz M., Korczynski M., Dobrzynski M. et al. Materials. V. 10, 2017. P. 590; DOI:10.3390/ma10060590

15. Ooi C.H., Ling Y.P., Abdullah W.Z. et al. J Mater Sci Mater Med. V. 30(4). 2019. P. 44. DOI: 10.1007/s10856- 019-6247-5.

16. Radha G., Balakumar S., Venkatesan B., Vellaichamy E. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. V. 50. 2015. P. 143– 50. DOI: 10.1016/j.msec.2015.01.054.


Просмотров: 45


ISSN 1992-7223 (Print)