Preview

Российские нанотехнологии

Расширенный поиск
Изображение на обложке

Исследование и оценка токсичности наночастиц оксида кальция при однократной ингаляционной экспозиции

https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-9-10-94-100

Полный текст:

Аннотация

При однократной четырехчасовой ингаляционной экспозиции аэрозолем водной суспензии наночастиц оксида кальция (СаО) в фактической концентрации 6.68 мг/м3 повышается концентрация кальция в легких (в 1.52 раза), головном мозге (в 1.55 раза) и печени (в 1.25 раза) относительно контроля, в то время как при действии микродисперсного аналога в концентрации 6.37 мг/м3 повышение данного показателя отмечено только в головном мозге (в 1.27 раза). При этом концентрация кальция в головном мозге животных опытной группы выше, чем в группе сравнения (в 1.22 раза). После действия нано- и микрочастиц СаО в тканях головного мозга установлено субарахноидальное кровоизлияние. Развитие патоморфологических изменений в виде гиперплазии лимфоидной ткани, эозинофилии, острого полнокровия и геморрагических инфарктов легких, а также гидропической и гиалиново-капельной дистрофий паренхиматозной ткани печени зафиксировано только после экспозиции наночастицами СаО. Выявленные особенности бионакопления и патоморфологических изменений при ингаляционном действии наночастиц СаО свидетельствуют о большей токсичности исследуемого наноматериала в сравнении с микродисперсным аналогом.

ВВЕДЕНИЕ

Повсеместное внедрение наноматериалов окажет, как ожидается, значительное влияние на различные сферы хозяйственной деятельности человека, что приведет к улучшению и даже рево­люционным изменениям во многих технологиях и отраслях [1]. Прогнозируемые ожидания связаны с уникальными физико-химическими свойствами наноматериалов, обусловленными малым разме­ром, высокой площадью поверхности, формой, поверхностным зарядом и др. В то же время при­сущие наноматериалам свойства обусловливают их высокую проникающую способность, следстви­ем чего может являться увеличение токсических свойств при поступлении в организм человека на всех этапах производства и потребления про­дукции [2].

Одним из таких материалов являются наноча­стицы оксида кальция (СаО). В связи с наличи­ем антибактериальных свойств они применяются в медицине в составе бактерицидных препаратов, а также в пищевой промышленности в качестве компонента упаковки продуктов и в процессах по очистке воды [3—5]. Кроме того, наночастицы СаО используются в составе огнезащитных мате­риалов, биотопливных систем, при очистке мест­ности от загрязнения компонентами химического оружия [5, 6].

Известно, что повреждающее действие наноча­стиц СаО на органы и ткани проявляется при перо- ральном поступлении в организм [7], что указывает на их способность проникать через эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта. Кроме того, есть вероятность преодоления наночастицами СаО гематоэнцефалического барьера [8]. Имеют­ся данные о способности изучаемых наночастиц продуцировать активные формы кислорода (АФК) [9], которые в дальнейшем могут разрушить кле­точную стенку бактерий, реагируя с карбонильной группой в пептидных связях полиненасыщенных фосфолипидов — одного из компонентов кле­точной стенки [9]. Наночастицы СаО способны разрушать клеточную мембрану, взаимодействуя с амидными структурами белков, входящих в ее состав [9]. В исследовании [8] подкожное введение изучаемого наноматериала крысам в течение трех месяцев привело к дегенерации и некрозу тканей печени и почек и кровоизлияниям в почках и го­ловном мозге. Выявлена токсичность наночастиц СаО для водных организмов Cyprinus carpio и Danio rerio: концентрация, при которой достигалась ги­бель 50% особей экспонированных групп (LC50), составила 235 и 260 мг/дм3 соответственно, гибель 100% особей наблюдалась при концентрациях 280 и 400 мг/дм3 соответственно [10, 11].

Учитывая достаточно широкий спектр приме­нения в различных отраслях промышленности, наличие токсических свойств у наночастиц СаО, а также отсутствие сведений об ингаляционной токсичности данного наноматериала, особую акту­альность приобретают исследования, направлен­ные на составление токсиколого-гигиенической характеристики нанодисперсного СаО при инга­ляционном пути поступления в организм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве тестируемого образца использовали порошок нанодисперсного СаО (Calcium oxide, CAS 1305-78-8, № NG04SO1704) производства компании Nanografi (Турция). Для сравнительного анализа использовали порошок микродисперсного СаО (Calcium oxide, CAS 1305-78-8, № 229539) производства компании Sigma-Aldrich (США).

Оценка размера частиц СаО выполнена мето­дом растровой электронной микроскопии (РЭМ) на сканирующем микроскопе высокого разре­шения S-3400N (Hitachi, Япония). Форму частиц и характер поверхности определяли методом ана­лиза изображений с использованием универсаль­ного программного обеспечения ImageJ-FiJi.

Эксперимент выполнен на половозрелых сам­цах крыс линии Wistar массой 250—300 г в соот­ветствии с ГОСТ 32646-2014, требованиями этиче­ского комитета ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью насе­ления и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных [12]. Экспериментальных животных (n = 36) случайным образом распреде­лили на опытную группу (n = 12), группу сравне­ния (n = 12) и контрольную группу (n = 12). Жи­вотных опытной группы подвергали однократной четырехчасовой ингаляционной экспозиции аэро­золем водной суспензии нанодисперсного СаО, животных группы сравнения — при тех же услови­ях аэрозолем водной суспензии микродисперсного СаО в ингаляционной системе с интегрированным программным обеспечением с использованием камеры для всего тела (TSE Systems GmbH, Гер­мания). Для генерирования аэрозолей исполь­зовали водные суспензии наноразмерного СаО и его микродисперсного аналога в концентрации 125 мг/см3. Животные контрольной группы на пе­риод эксперимента находились в аналогичных ус­ловиях, но не подвергались ингаляционной экс­позиции данных веществ. На период экспозиции корм животные не получали. После проведения ингаляционной экспозиции период наблюдения за животными составил 14 сут для установления возможной отложенной токсичности вещества. Характеристика воздушных потоков в камере: приток воздуха — 10 дм3/мин (концентрация кис­лорода не менее 19%, углекислого газа не менее 1%); скорость подачи водных суспензий нано- и микродисперсного СаО — 0.4 см3/мин; отток воздуха — 10 дм3/мин; колебания давления внутри камеры — 0.4 мбар; температура в камере на протя­жении всего эксперимента — 22—25°С. Отбор проб воздуха из камеры для определения концентра­ции тестируемых веществ осуществляли на фильтр АФА-ХП-10-1 на протяжении всего времени экс­позиции со скоростью подачи 2 дм3/мин. Факти­ческая концентрация нанодисперсного СаО в воз­духе ингаляционной камеры составила 6.68 мг/м3, микродисперсного СаО — 6.37 мг/м3.

По окончании срока наблюдения животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации. Для изучения бионакопления каль­ция у шести животных из каждой группы отбира­ли легкие, печень, почки, головной мозг и кровь. Отобранные образцы в течение 9 ч подвергали тер­мическому озолению в муфельной печи при тем­пературе 450—500°С. Количественное определение содержания кальция в образцах осуществляли ме­тодом фотометрии с индикаторным реактивом арсеназо III на биохимическом автоматическом ана­лизаторе Konelab 20 (ThermoFisher, Финляндия) при длине волны в 650 (640—670) нм.

Проведено гистологическое исследование лег­ких, печени, почек и головного мозга у шести животных каждой экспериментальной группы. Извлеченные органы фиксировали в 10%-ном рас­творе забуференного нейтрального формалина. Дегидратацию фиксированных кусочков тканей проводили в автоматическом гистологическом про­цессоре “Excelsior ES” (Thermo Scientific, Германия). Гистологические препараты изготавливали из па­рафиновых срезов толщиной 3—4 мкм, окрашивая по общепринятой методике гематоксилином и эо­зином в роботе-окрашивателе “Varistain Gemini ES” (Thermo Scientific, Германия). Микрофотографии сделаны с помощью камеры “Mikroskopkamera AxioCam ERc 5s” (Carl Zeiss, Германия).

Математическую обработку результатов иссле­дования осуществляли с помощью параметриче­ских методов статистики, предварительно оцени­вали соответствие полученных результатов закону нормального распределения, выполняли расчет выборочного среднего (М) и стандартной ошибки (m), проверку гипотезы о совпадении выборочных средних с использованием i-критерия Стьюдента. Различия полученных результатов считали стати­стически значимыми прир < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам РЭМ установлено, что средний размер частиц нативного нанопорошка СаО со­ставляет 343.10 ± 10.15 нм, что в 19.24 раза меньше данного показателя у частиц микропорошка (6600 ± 600 нм) (рис. 1). При этом большая доля частиц на­нопорошка (более 55%) имеет размер до 100 нм. При анализе изображений, полученных методом РЭМ, установлено, что коэффициент округлости (сферичности) наночастиц СаО размером до 100 нм равен 0.92 ± 0.03, что достоверно отличается от дан­ного показателя у частиц размером более 100 нм (0.77 ± 0.04), входящих в состав нанопорошка (р < 0.0001). Форма частиц размером до 100 нм при­ближена к сферической. Коэффициент сферичности микрочастиц СаО составил 0.79 ± 0.08, что достовер­но меньше в 1.17 раза (р = 0.003), чем данный показа­тель у наночастиц. Форма микрочастиц приближена к кубической. При трехмерной реконструкции нано­частиц СаО установлено, что их поверхность не со­держит значимых перепадов рельефа, это позволяет в дальнейшем рассматривать их как гладкие (рис. 2). Поверхность частиц микродисперсного аналога име­ет шероховатый характер со средней величиной не­ровностей 0.15 ± 0.07 мкм (рис. 2).

 

Рис. 1. РЭМ-изображение наночастицы СаО (а) и микрочастицы (б).

 

 

Рис. 2. Изометрическая трехмерная реконструкция поверхности наночастицы СаО (а) и микрочастицы (б).

 

При исследовании бионакопления тестируе­мых веществ установлено, что после однократной ингаляционной экспозиции нанодисперсным СаО в течение 4 ч концентрация кальция повы­шается в легких, мозге и печени эксперимен­тальных животных в 1.52 (р = 0.001), 1.55 (р = 0.0004) и 1.25 раза (р = 0.001) соответственно в сравнении со значениями данного показателя у животных контрольной группы. Схожие изме­нения отмечены при сопоставлении групп опы­та и сравнения: концентрация кальция в легких, мозге и печени после экспозиции нанодисперсным СаО выше, чем при воздействии микро­дисперсного аналога в 1.52 (р = 0.004), 1.22 (р = 0.020) и 1.32 раза (р < 0.0001) соответственно. У животных экспонированных микрочастица­ми СаО концентрация кальция относительно контроля повышается только в головном мозге в 1.27 раза (р= 0.021) (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты исследования бионакопления кальция в органах крыс линии Wistar при однократной ингаляционной экспозиции аэрозолем водной суспензии нано- и микродисперсного оксида кальция (р < 0.05)

Группа животных

Показатель

Концентрация кальция в органе, ммоль/дм3

легкие

почки

мозг

печень

кровь

Контрольная группа

Среднее значение (M ± m)

2.02 ± 0.31

1.00 ± 0.19

1.46 ± 0.33

3.59 ± 0.41

0.18 ± 0.03

Группа сравнения

Среднее значение (M ± m)

2.02 ± 0.55

0.86 ± 0.10

1.86 ± 0.14

3.39 ± 0.30

0.19 ± 0.04

Межгрупповое разл с контролем (p)

0.998

0.141

0.021

0.285

0.553

Кратность различий с контролем

ниже

выше

1.00

1.17

-

1.06

-

-

-

1.27

-

1.07

Опытная группа

Среднее значение (M ± m)

3.07 ± 0.48

1.05 ± 0.21

2.26 ± 0.23

4.47 ± 0.18

0.17 ± 0.03

Межгрупповое различие
с контролем (p)

0.001

0.686

0.0004

0.001

0.575

Кратность различий с контролем

ниже

-

-

-

-

1.05

выше

1.52

1.05

1.55

1.25

-

Межгрупповое различие
с контролем (p)

0.004

0.064

0.002

<0.0001

0.359

Кратность различий с группой сравнения

ниже

-

-

-

-

1.13

выше

1.52

1.22

1.22

1.32

-

Сравнительная оценка патоморфологических изменений исследуемых тканей органов позво­лила установить у животных групп опыта и срав­нения схожие изменения в головном мозге в виде субарахноидального кровоизлияния, не зафик­сированного у животных контрольной группы (рис. 3). У животных, экспонированных наноча­стицами СаО, в отличие от групп сравнения и кон­троля отмечены гиперплазия лимфоидной ткани, ассоциированной со стенкой бронхов и сосудов, эозинофилия, острое полнокровие, геморрагиче­ские инфаркты в тканях легких (рис. 4) и выражен­ная гидропическая и гиалиново-капельная дис­трофии в паренхиматозной ткани печени (рис. 5).

 

Рис. 3. Микрофотографии гистологических препаратов тканей головного мозга крыс линии Wistar (окраска гема­токсилин-эозином, масштаб 400:1): а — опытная группа, б — группа сравнения, в — контрольная группа.

 

 

Рис. 4. Микрофотографии гистологических препаратов тканей легких крыс линии Wistar (окраска гематоксилинэозином, масштаб 100:1): а — опытная группа, б — группа сравнения, в — контрольная группа.

 

 

Рис. 5. Микрофотографии гистологических препаратов тканей печени крыс линии Wistar (окраска гематоксилин- эозином, масштаб 200:1): а — опытная группа, б — группа сравнения, в — контрольная группа.

 

Исследованный образец СаО является нано­материалом, так как более 55% частиц, входящих в состав порошка, принадлежит наноразмерной фракции. Установленные параметры размера, фор­мы и характера поверхности наночастиц подтверж­дают их высокую степень проникающей способ­ности и, следовательно, позволяют предположить более выраженную токсичность относительно ми- кроразмерного аналога. По результатам исследова­ния бионакопления установлено, что при ингаля­ционном пути поступления нано- и микрочастицы СаО накапливаются в головном мозге, при этом степень накопления более выражена у наномате­риала, который в отличие от микроматериала так­же аккумулируется в легких и печени. В головном мозге животных обеих экспонированных групп об­наружено патоморфологическое изменение в виде субарахноидального кровоизлияния, что совпа­дает с полученными ранее результатами [8]. Один из механизмов формирования субарахноидального кровоизлияния, возможно, связан с накоплением кальция в артериях [13], однако в представленном эксперименте гистологическими методами иссле­дования не установлено наличия кальция в сосудах головного мозга. Причина развития субарахноидального кровоизлияния в данном случае, веро­ятно, связана с возможным нарушением функций плотных контактов [14] и/или перицитов [15] ге- матоэнцефалического барьера. Для установления точного механизма действия наночастиц СаО на головной мозг требуются более углубленные ис­следования. Острое полнокровие и геморрагиче­ские инфаркты, зафиксированные в тканях легких животных опытной группы, указывают на нару­шение кровообращения. Кроме того, лимфоидная ткань легких животных опытной группы подвер­жена гиперплазии, которая, вероятно, развивается в ходе воспалительного процесса, вызванного дей­ствием АФК, [16, 17] продуцированных наночасти­цами СаО. Генерация АФК может лежать в основе механизма развития дистрофических изменений, установленных в паренхиматозной ткани печени. Как известно, АФК ингибируют действие натрий- калиевой аденозинтрифосфатазы [18], одновре­менно с этим ионы Са2+, поступающие в клетку, вытесняют ионы К+. Избыток ионов Са2+ в цито­золе активирует кальциевый насос, с помощью ко­торого клетка пытается избавиться от избытка Са2+ через эндоплазматическую сеть [19], где происхо­дит накопление воды и ионов, приводящее к рас­ширению канальцев и цистерн данной органеллы, что, в свою очередь, вызывает гидропическую дис­трофию [20]. Развитие гиалиново-капельной дис­трофии гепатоцитов, вероятно, является проявле­нием извращенного синтеза белка, который может указывать на развитие ответной воспалительной реакции в паренхиме печени [20] на продукцию АФК. В исследовании [8] установлены патомор­фологические изменения паренхиматозной ткани печени в виде дегенерации гепатоцитов после экс­позиции наночастицами СаО, что согласуется с по­лученными в ходе данного исследования результа­тами, а также некроза, развитие которого является закономерным при дистрофиях и в данном случае проявляется, вероятно, из-за более длительного срока экспозиции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполненных исследований уста­новлено, что наночастицы СаО при однократной ингаляционной экспозиции обладают более выра­женной материальной кумуляцией по сравнению с микродисперсным аналогом и накапливаются в головном мозге, легких и печени крыс линии Wistar. Действие нано- и микрочастиц СаО вызывает сопоставимо выраженные патоморфологические изменения в тканях головного мозга, однако на­номатериал обладает большей степенью токсично­сти, что проявляется в изменениях тканей легких и печени, не установленных при экспозиции микроразмерным СаО. Полученные результаты необ­ходимо учитывать для повышения эффективности обоснования мер профилактики для работающих и населения, подвергающихся ингаляционной экспозиции наночастицами СаО в процессе про­изводства и потребления продукции.

Список литературы

1. Benefits and Applications // National Nanotechnology Initiative. https://www.nano.gov/you/nanotechnology-benefits (дата обращения 21.01.2020).

2. Sukhanova A., Bozrova S., Sokolov P. et al. Dependence of Nanoparticle Toxicity on Their Physical and Chemical Properties // Nanoscale Research Letters. 2018. V. 13. № 44. P. 21. https://doi.org/10.1186/s11671-018-2457-x.

3. Abraham S., Saranthy V.P. Biomedical applications of calcium oxide nanoparticles – a spectroscopic study // Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 2018. V. 49. № 1. P. 121.

4. Batt C., Tortorello M. Encyclopedia of food microbiology. Second edition. San Diego. Academic Press Elsevier, 2014. 1014 p.

5. Calcium Oxide (CaO) Nanoparticles – Properties, Applications // AZoNano. 2013. https://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=3365 (дата обращения 21.01.2020).

6. Bai H., Shen X., Liu X. et al. Synthesis of porous CaO microsphere and its application in catalyzing transesterification reaction for biodiesel // Trans. Nanferrous. Met. 2009. V. 19. № 3. P. 674. https://doi.org/10.1016/S1003-6326(10)60130-6

7. Al-Shaibani S. The Effect of Calcium Oxide-Nanoparticles on the Function of the Kidney Organ in the Rats // Journal of Engineering and Applied Sciences. 2018. V. 13. № 18. P. 7689.

8. Butt A.R., Ejaz S., Baron J.C. et al. CaO nanoparticles as a potential drug delivery agent for biomedical applications // Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2015. V. 10. № 3. P. 799.

9. Gedda G., Pandy S., Lin Y.-C. et al. Antibacterial effect of calcium oxide nano-plates fabricated from shrimp shells // Green Chemistry. 2015. V. 17. № 6. P. 3276. https://doi.org/10.1039/C5GC00615E

10. Bhavya C., Yogendra K., Mahadevan K.M. et al. Synthesis of Calcium Oxide Nanoparticles and Its Mortality Study on Fresh Water Fish Cyprinus Carpio // IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology. 2016. V. 10. № 12. P. 55.

11. Kovrižnych J., Sotnikova R., Zeljenkova D. et al. Acute toxicity of 31 different nanoparticles to zebrafish (Danio rerio) tested in adulthood and in early life stages – comparative study // Interdisciplinary Toxicology. 2013. V. 6. № 2. P. 67. https://doi.org/10.2478/intox-2013-0012

12. Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (Guide for the care and use of laboratory animals) // National Research Council of the national academies. Washington: The national academies press, 2011. 248 p.

13. Goldstein S.J., Sacks J.G., Lee C. et al. Computed Tomographic Findings in Cerebral Arterial Ectasia // American Journal of Neuroradiology. 1983. № 4. P. 501.

14. Kim Jung Hun, Kim Jin Hyoung, Park J.A., Lee S.W. et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface // J. Biochem. Mol. Biol. 2006. V. 39. № 4. P. 339. https://doi.org/10.5483/bmbrep.2006.39.4.339

15. Liu S., Agalliu D., Yu C., Fisher M. The role of pericytes in blood-brain barrier function and stroke // Curr Pharm Des. 2012. V. 18. № 25. P. 3653. https://doi.org/10.2174/138161212802002706

16. Pease C., Rucker T., Birk T. Review of the Evidence from Epidemiology, Toxicology and Lung Bioavailability on the Carcinogenicity of Inhaled Iron Oxide Particulates // Chemical Research in Toxicology. 2016. V. 29. № 3. P. 237. https://doi.org/10.1021/acs.chemrestox.5b00448

17. Lambrecht B.N., Hammad H. The immunology of asthma // Nature Immunology. 2015. V. 16. № 1. P. 45. https://doi.org/10.1038/ni.3049

18. Petrushanko I., Bogdanov N., Bulygina E. et al. Na-K-ATPase in rat cerebellar granule cells is redox sensitive // American Journal of Physiology, Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 2006. V. 290. № 4. P. R916. https://doi.org/10.1152/ajpregu.00038.2005

19. Медицинская биофизика: учебник для вузов / Под ред. Самойлов В. 3-е изд., испр. И доп. СПб.: СпецЛит, 2013. 591 с.

20. Патологическая анатомия: учебник / Под ред. Струков А.И., Серов В.В. 5-е изд., стер. М.: Литтерра, 2010. 880 с.


Об авторах

Н. В. Зайцева
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения
Россия


М. А. Землянова
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения; Пермский государственный национальный исследовательский университет; Пермский национальный исследовательский политехнический университет
Россия


М. С. Степанков
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения; Пермский государственный национальный исследовательский университет
Россия


А. М. Игнатова
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения; Пермский национальный исследовательский политехнический университет
Россия


Просмотров: 61


ISSN 1992-7223 (Print)